近期，江南大學(xué)生物工程學(xué)院陳堅院士團隊劉龍教授課題組在轉(zhuǎn)錄因子工程和輔因子工程策略協(xié)同提高N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)方面取得重要進展，研究成果“Synergistic improvement of N-acetylglucosamine production by engineering transcription factors and balancing redox cofactors”正式發(fā)表于metabolic Engineering （IF=9.783） （https://doi.org/10.1016/j.ymben.2021.07.012）。

 

　　對代謝途徑中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控是代謝工程常用策略，但該策略往往不能明顯提高目標(biāo)產(chǎn)物的效價，甚至導(dǎo)致工程菌株胞內(nèi)碳/氮代謝網(wǎng)絡(luò)和輔因子網(wǎng)絡(luò)的失衡。全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程通過采用具有特定功能的轉(zhuǎn)錄因子來激活或抑制特定代謝途徑中多個基因的協(xié)同表達，從而可以有效提高目標(biāo)代謝物的合成。同時，目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成途徑中普遍涉及多種輔因子，而輔因子供應(yīng)不足和輔因子不平衡等問題往往成為高效生物合成的重要瓶頸。因此，為實現(xiàn)目標(biāo)代謝物的高效合成，平衡工程菌株的碳/氮代謝轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)和氧化還原代謝網(wǎng)絡(luò)是至關(guān)重要的。

 

　　針對上述問題，該研究首先驗證了碳代謝的七種全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GlxR、RamA、RamB、SugR、LldR、FruR和GntR1對谷氨酸棒狀桿菌產(chǎn)生GlcNAc的影響。結(jié)果表明，過表達RamA的重組菌株的GlcNAc產(chǎn)量提升最為明顯，而高表達RamB、LldR和FruR的菌株的GlcNAc產(chǎn)量減少。因此，進一步構(gòu)建了RamA的A結(jié)構(gòu)域（轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域）和B結(jié)構(gòu)域（DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）的突變體庫，并采用高通量篩選的方法從中篩選正突變體并進行組合突變。通過表達組合突變型轉(zhuǎn)錄因子RamAM，使得GlcNAc在搖瓶中的效價提高到16 g/L，進一步通過轉(zhuǎn)錄組測序及ITC實驗解析了突變菌株高產(chǎn)GlcNAc的原因。其次，研究人員在谷氨酸棒桿菌中開發(fā)了基于dCpf1的CRISPRi系統(tǒng)，還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子RamB、LldR、FruR以及AmtR對GlcNAc的產(chǎn)生具有負向調(diào)節(jié)作用，因此，研究人員將CRISPRi系統(tǒng)運用于干擾對GlcNAc合成呈現(xiàn)抑制作用的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而促進GlcNAc的效價進一步提高至27.5 g/L；之后，由于細胞內(nèi)輔因子代謝網(wǎng)絡(luò)可以通過修飾目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑中氧化還原反應(yīng)相關(guān)酶的輔因子偏好性來平衡，研究人員通過數(shù)據(jù)庫搜索和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)序列比對，對GlcNAc合成途徑中的關(guān)鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）的輔因子結(jié)合口袋附近的氨基酸殘基進行了一系列突變。通過篩選發(fā)現(xiàn)突變體GAPDH N208R/F323S和MDH E47G/A51S具有有益效果，使GlcNAc在搖瓶中的效價提高到36.9 g/L；最后，為了擴大了GlcNAc的生產(chǎn)規(guī)模，研究人員將重組谷氨酸棒桿菌在50-L發(fā)酵罐中進行放大生產(chǎn)，放大生產(chǎn)所得GlcNAc效價達117.1 g/L，為對照組的6.62倍，與此同時，葡萄糖轉(zhuǎn)化至GlcNAc的轉(zhuǎn)化率也從0.19 g/g提高到0.31 g/g。該研究所開發(fā)的一系列策略有助于優(yōu)化細胞內(nèi)碳氮代謝網(wǎng)絡(luò)的全局轉(zhuǎn)錄水平以及細胞內(nèi)輔因子水平，為重構(gòu)微生物代謝網(wǎng)絡(luò)和提高微生物細胞工廠的性能提供了新的方法和思路。

 

　　劉龍教授為論文通訊作者，生物工程學(xué)院2017級博士生鄧琛為第一作者。上述研究工作得到了國家自然科學(xué)基金（32021005, 31930085）、國家重點研發(fā)項目（2018YFA0900300, 2018YFA0900504）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助（JUSRP52019A）、山東省重點R&D項目（重大科技創(chuàng)新項目）（2019JZZY 011002）等項目的資助。