近年來(lái)，伴隨CRISPR/Cas9基因精確編輯體系的發(fā)展，克隆技術(shù)在豬分子育種上的應(yīng)用潛力逐漸顯現(xiàn)，一批與優(yōu)勢(shì)經(jīng)濟(jì)性狀和抗病性狀相關(guān)的克隆豬模型被紛紛創(chuàng)制。而由于豬和人類生理結(jié)構(gòu)的相似性，克隆豬模型還可應(yīng)用于人類器官再造和疾病病理研究，這都反映出豬克隆技術(shù)在農(nóng)業(yè)育種和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域存在巨大的應(yīng)用前景。非瘟疫情影響下，克隆技術(shù)還能應(yīng)用于地方種、引進(jìn)種和新培育豬品種的種質(zhì)資源保存。

 

　　不過(guò)自克隆羊“多莉”誕生以來(lái)，哺乳動(dòng)物克隆胚胎早期發(fā)育的高損率（克隆囊胚率僅10-15%，受精囊胚率可達(dá)30-80%）和極低的出生效率（克隆動(dòng)物約1-2%，受精動(dòng)物可達(dá)40-60%）一直是限制克隆技術(shù)推廣應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，受體卵母細(xì)胞對(duì)供體細(xì)胞基因組存在天然的重編程障礙，導(dǎo)致克隆胚胎出現(xiàn)表觀遺傳修飾的異常富集和相應(yīng)基因的異常表達(dá)，而尋找克服重編程障礙的有效方法一直是突破豬克隆技術(shù)應(yīng)用壁壘的研究熱點(diǎn)。

 

　　本研究首次結(jié)合近年來(lái)開(kāi)發(fā)的低細(xì)胞量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Smart-seq）技術(shù)，從全基因組層面鑒定了豬克隆胚胎在合子基因組激活階段（4細(xì)胞期）異常表達(dá)的基因和基因組區(qū)域。同時(shí)，利用低細(xì)胞量的全基因組DNA甲基化測(cè)序（PBAT-seq）和染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ULI-NChIP-seq）技術(shù)，確定了上述異常表達(dá)的基因啟動(dòng)子和基因組區(qū)域中存在高水平富集的DNA甲基化和組蛋白甲基化H3K9me3、H3K27me3。最重要的是，針對(duì)這些重編程障礙，該研究開(kāi)發(fā)了兩項(xiàng)有效提高豬克隆胚胎發(fā)育能力的新方法：1）聯(lián)合使用顯微注射技術(shù)在克隆胚胎中過(guò)表達(dá)H3K9me3的去甲基化酶KDM4A，并向胚胎培養(yǎng)液中添加H3K27me3編寫酶抑制劑GSK126；2）使用誘導(dǎo)表達(dá)與DNA去甲基化相關(guān)的胸腺嘧啶糖基化酶TDG的供體細(xì)胞株構(gòu)建克隆胚胎。上述克服途徑均不同程度地調(diào)整了豬克隆胚胎基因和基因組區(qū)域的異常表達(dá)，并最終使克隆胚胎的囊胚率提高近兩倍。

　　豬克隆胚胎在合子基因組激活階段的重編程障礙和克服途徑

 

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院副研究員劉鑫和王濤博士、生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院陳露博士后為論文的共同第一作者，我校苗義良教授和陳振夏教授為論文通訊作者。本研究受到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和國(guó)家自然科學(xué)基金的資助。

 

　　【英文摘要】

 

　　Pig cloning by somatic cell nuclear transfer （SCNT） frequently undergoes incomplete epigenetic remodeling during the maternal-to-zygotic transition, which leads to a significant embryonic loss before implantation. Here, we generated the first genome-wide landscapes of histone methylation in pig SCNT embryos. Excessive H3K9me3 and H3K27me3, but not H3K4me3, were observed in the genomic regions with unfaithful embryonic genome activation and donor-cell-specific gene silencing. A combination of H3K9 demethylase KDM4A and GSK126, an inhibitor of H3K27me3 writer, were able to remove these epigenetic barriers and restore the global transcriptome in SCNT embryos. More importantly, thymine DNA glycosylase （TDG） was defined as a pig-specific epigenetic regulator for nuclear reprogramming, which was not reactivated by H3K9me3 and H3K27me3 removal. Both combined treatment and transient TDG overexpression promoted DNA demethylation and enhanced the blastocyst-forming rates of SCNT embryos, thus offering valuable methods to increase the cloning efficiency of genome-edited pigs for agricultural and biomedical purposes.

 

　　論文鏈接：https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711（21）00489-6